《食物科学》：高密度作育对猪肌肉干细胞运气的影响

　　细胞培植肉是指用畜禽干细胞通过体外培摄生产出的肉类，是一种新兴肉类坐褥技能，其上风是低碳环保，来日可举动古代肉类的替换卵白供应。 肌肉干细胞是培植肉要紧的种子细胞之一。肌肉干细胞是肌肉机合里的专灵巧细胞，当肌肉机合涌现毁伤时，肌肉干细胞可有用修复和再生肌纤维。正在肌肉干细胞的大界限培植流程中，因为细胞的贴壁滋长性情，不管正在2D培植皿照旧3D微载体上，极易涌现密度较高的处境。

　　南京农业大学食物科学技能学院的林玲，丁世杰*，周光宏*等通过对猪肌肉干细胞转录组剖判及验证并体系性地探究高密度培植对猪肌肉干细胞运道的影响，旨正在为细胞培植肉商讨正在高密度前提下调动细胞增殖瓦解供给肯定参考按照。

　　为探究区别接种密度短期培植对肌肉干细胞的影响，将诀别取得的猪肌肉干细胞传至第5代后以区别密度接种至细胞培植皿。从图1A能够看到，肌肉干细胞大部门呈梭状，部门刚杀青碎裂的肌肉干细胞呈圆形。跟着接种密度普及，细胞互相接触水平渐渐加强，最高密度组细胞全体接触，细胞显露出协调瓦解的趋向。将细胞消化计数，结果显示终密度差异为1。780×10 4 、3。226×10 4 、5。066×10 4 、6。264×10 4 cells/cm 2 （图1B），细胞差异增殖了6。59、5。97、4。60、2。85 倍（图1C）。3组细胞扩增倍数比拟比照组差异删除了9。3%、28。8%、56。0%。

　　为了从分子秤谌进一步清楚高密度对猪肌肉干细胞增殖的影响，本商讨以磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）卵白的外达处境进一步剖判。如图2所示，区别密度接种培植3d后的细胞ERK卵白秤谌正在前3个密度下无显明转化，最高接种密度组p-ERK1下调为比照组的58。6%（图2B）。犹如的，最高密度组p-ERK2下调为比照组的57。7%（图2C）。综上所述，猪肌肉干细胞正在3d内的扩增倍数随接种密度升高而渐渐消浸，且消浸幅度随接种密度升高而加大。同时高密度培植下p-ERK卵白的外达量下调，进一步外明高密度培植抑低猪肌肉干细胞增殖。

　　上述结果解释，高密度培植的猪肌肉干细胞增殖受到明显抑低，为了体系性清楚高密度接种前提下细胞基因外达谱的转化，对2。7×10 3 cells/cm 2 （比照组，L-D3）和2。2×10 4 cells/cm 2 （试验组，H-D3）两组细胞样品举行转录组测序，将测序结果举行主因素剖判（PCA）、基因不同外达剖判、不同基因京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通道剖判。如图3A所示，试验组与比照组的离散水平较大，解释两组样品的不同性较大。据测序结果，采取log 2 Fold change绝对值大于1，即细胞的基因外达正在管理组和比照组中外达量上调/下调超出2倍的基因举行不同 外达剖判。如图3B所示，和比照组比拟，H-D3组明显上调超出2倍的基因共1301个，明显下调2倍的基因共824个。如图3C所示，H-D3与L-D3两组中不同外达基因重要富集正在细胞衰老、PI3K-Akt信号通道和细胞周期等通道。这些结果解释，高密度培植更易产生细胞衰老、细胞周期卵白外达分外转化，这些信号通道的转化可以是酿成高密度下猪肌肉干细胞增殖减缓以及干性没落的要紧来历之一，有待于进一步商讨。

　　通过筛选每千碱基外显子的序列片断数（FPKM）发明，比照组PAX3和PAX7的FPKM较低，而高密度前提下PAX3和PAX7的外达量有肯定上调（图4A、B）。别的，Sprouty1（SPRY1）是酪氨酸激酶受体信号传导抑低基因，日常正在静息状况下PAX7阳性的肌肉干细胞中高外达，跟着肌肉干细胞的激活，外达量渐渐下调。肌肉干细胞正在修复毁伤后，SPRY1是一部门肌肉干细胞从头酿成静息状况下，坚持干细胞池稳态必不行少的基因。SPRY1基因的FPKM结果显示，高密度前提下该基因也涌现了上调外达（图4C），解释高密度前提下部门猪肌肉干细胞可以转动成了静息状况下的干细胞。

　　针对瓦解联系基因MYOD和MYOG的转录组学数据剖判结果显示（图4D、E），外征瓦解肇始的基因MYOD和外征瓦解经过中后期的标识性基因MYOG正在高密度培植3 d前提下上调。别的，胚胎骨骼肌肌球卵白重链3（MYH3）外征细胞瓦解酿成再造肌管，其跟着密度升高而上调外达进一步显露了瓦解经过（图4F）。以上结果解释，高密度可以推进了肌肉干细胞的瓦解经过。

　　转录组学信号通道剖判结果显示，高密度前提下细胞产生了衰老，对标识性的衰老基因举行了剖判。商讨发明P21参加甲基化介导的生物体衰老流程，P53是细胞衰老的重要调动因子，敲除P15等能有用抑低人类真皮干细胞的衰老。所以P21、P53和P15举动经典的衰老联系基因，被选为剖判衰老基因外达转化的目的基因。P21、P53和P15基因的FPKM的结果显示（图4G～I），3 个衰老基因的外达都涌现了上调，解释高密度前提下部门猪肌肉干细胞可以涌现了衰老。

　　经由卵白免疫印迹检测，如图5A所示，与比照组比拟，5。4×103、1。1×104、2。2×104 cells/cm2组PAX7的卵白外达秤谌差异上调到1。70、2。66、2。70倍，高密度培植明显上调PAX7的卵白外达（P＜0。01）。本商讨结果显示，SPRY1正在转录秤谌上跟着接种密度的升高而升高，和比照组比拟，5。4×103、1。1×104、2。2×104 cells/cm2组差异上调到1。07、1。25、1。81 倍，最高密度组的SPRY1外达明显升高（P＜0。01）（图5B）。结果解释，猪肌肉干细胞正在肯定的高密度培植前提下，可以是通过SPRY1的影响，让一部门肌肉干细胞由激活状况从头酿成静息状况，从而上调了PAX7的外达。以上结果解释正在一样的培植时代内，猪肌肉干细胞的干性随接种密度升高而升高。

　　为了检测高密度培植对肌肉干细胞瓦解材干的影响，运用real-time PCR和Western Blot检测了瓦解症结基因MYOG的外达。如图5C所示，realtime PCR结果显示，和比照组比拟，5。4×103、1。1×104和2。2×104 cells/cm2组的MYOG正在转录秤谌差异上调到2。08、10。68、68。35 倍，最高密度组比比照组有明显上调（P＜0。05）。正在卵白秤谌，5。4×103、1。1×104、2。2×104 cells/cm2组的MYOG卵白秤谌差异上调到1。42、1。36、4。13 倍，最高密度组明显上调（P＜0。001），以上结果阐述正在高密度培植前提下，部门肌肉干细胞进入了细胞的瓦解经过。

　　转录组学商讨显示，高密度培植抑低肌肉干细胞增殖，且高密度下衰老联系通道中的P21等基因明显上调，为了验证转录组学的商讨结果，检测了衰老联系基因P21的外达。如图5D所示，培植3d后P21的转录秤谌跟着接种密度的升高而升高，5。4×103、1。1×104、2。2×104 cells/cm2组差异上调为比照组的1。72、3。25、4。29 倍，高密度两组明显上调（P＜0。01）。所以，正在高密度前提下，细胞周期卵白的外达转化可以是细胞增殖材干转化的潜正在来历，但其上逛通道中基因的外达处境还需求进一步商讨。

　　以上结果解释，高密度培植前提一方面促使部门细胞进入静息状况坚持干细胞池；另一方面推进部门细胞肌源瓦解，同时还导致了肯定数目细胞的衰老。

　　已有大宗商讨解释，动物细胞正在高密度培植前提下会产生“接触抑低”景象，即细胞的增殖材干明显消浸。商讨发明p27Kip1上调、cyclin A下调是星形胶质细胞增殖发生接触抑低的来历。列入外源性外皮滋长因子（EGF）能普及高密度下的细胞增殖并酿成众个细胞层。但EGF的列入并不行很大水平地转变p27Kip1和cyclin A的秤谌，而是普及了cyclin D1的秤谌。正在FH109人胚胎成纤维细胞中，接触抑低仅通过相邻细胞上两种细胞卵白的互相影响介导，即通过糖卵白接触抑低素与之纠合，受体称为接触抑低素受体。肿瘤抑低因子p16lnk4和Cdk4之间缔合的增众以及p27Kip1和Cdk2/cyclin E复合体的缔合增众会发生抗增殖信号，从而导致细胞阻滞正在G1期。结果的结果是视网膜母细胞瘤基因产品维持低磷酸化状况，从而抑低其进入细胞周期S期的经过。所以，密度激励的细胞周期通道转化是细胞接触抑低最直接的来历。Leontieva等商讨发明，细胞衰老分两步产生，起首是细胞周期阻滞，这部门可由高密度惹起而且可逆，第二步是衰老转化，将可逆的阻滞变为不行逆的衰老，这部门与mTOR信号通道联系。本商讨结果显示，正在高密度前提下，猪肌肉干细胞也涌现了显明的接触抑低景象，联系细胞衰老和周期基因涌现了上调。别的，本商讨转录组学也揭示了联系不同卵白富集到了PI3K-Akt信号通道，与昔人的结果吻合。

　　PAX7是肌肉干细胞的干性标识基因，结果解释细胞干性随接种密度升高而增众。进一步商讨调动肌肉干细胞可逆的静止激活状况的基因SPRY1发明，SPRY1跟着密度的上升渐渐升高。SPRY1日常正在静息状况下PAX7阳性的肌肉干细胞高外达，跟着肌肉干细胞的激活外达量渐渐下调。若低落SPRY1的外达，则会明显删除静息状况下的肌肉干细胞而且普及了凋亡的细胞比例。别的，商讨发明SPRY1的影响可以是通过抑低ERK信号通道告竣。本商讨也发明了高密度培植下磷酸化ERK卵白的外达量下调。但正在高密度前提下，SPRY1调动猪肌肉干细胞的PAX7的外达还需求深切商讨。

　　高密度培植前提还会影响细胞的瓦解。比如，正在角质细胞瓦解计划中增众初始hPSC接种密度会增众瓦解终末K18＋/p63＋大略上皮细胞的数目，普及细胞纯度。Hsiao等商讨发明，正在贴壁处境下，hPSC瓦解为神经上皮祖细胞和神经元的动力学秤谌和瓦解水平以YAP依赖的式样受细胞接种密度影响，细胞接种密度越高，瓦解水平越高。Singh等商讨了胚胎干细胞向FLK1＋血管祖细胞的瓦解转动与细胞密度和细胞代谢的干系，发明这种转动依赖于较高的接种密度，且与代谢物的转动相合。正在间充质干细胞中，有商讨取得基质弹性和细胞密度是命令尘寰充质干细胞增殖和瓦解的要紧微情况身分。高密度培植后的骨髓间充质干细胞，其成骨瓦解水平更高并伴跟着ERK卵白外达的消浸。高密度培植也转变了牙髓干细胞的性情，并通过整合素信号的传导发生了更众悉力于成骨瓦解的细胞。正在本商讨中，也发明了高密度前提会激动成肌细胞的瓦解经过。

　　肌肉干细胞正在高密度培植前提下发生接触抑低，增殖减缓。本商讨通过转录组学和后续的验证，发明高密度培植一方面激动部门细胞进入静息状况坚持干细胞池，显露为干性基因上调；另一方面，高密度激动细胞瓦解经过，显露为瓦解联系基因上调；别的，高密度还导致了细胞衰老，显露为衰老基因上调。本商讨结果有助于知道高密度下细胞运道断定机制，为细胞培植肉商讨正在高密度前提下调动细胞增殖瓦解供给肯定的外面根蒂。

　　周光宏，教化，南京农业大学邦度肉品德地和平职掌工程技能商讨中央主任。现任肉品德地职掌与新资源创作天下核心试验室和邦度肉品德地和平职掌工程技能商讨中央主任，兼任中邦畜产物加工商讨会会长和邦际规范化机合“肉禽鱼蛋及其成品”委员会主席，是我邦肉品加工学科领先人和本范畴邦际著名专家。肉品加工是我邦新颖农业家当系统的要紧构成部门，干系邦计民生。周光宏教化正在我邦率先体系发展了肉品科学根蒂和运用商讨，针对我邦生鲜肉质地和平难以职掌、肉成品加工技能落伍、肉类坐褥和资源禀赋冲突日益特别的巨大家当题目，1）占据了冷却肉质地职掌难、冷却干耗大、保质期短的家当技能困难；2）揭示了由肌肉内源酶主导的我邦古代腌腊肉成品风韵酿成机制，研发出肉品风韵与凝胶品德职掌技能；3）创作出中邦第一块细胞培植肉，为我邦肉类坐褥可接连开展供给了新的技能贮备。

　　林玲，南京农业大学食物科技学院科研助理，女，汉族，1995年出生于江苏启东，本科和硕士阶段均就读于南京农业大学食物科技学院，攻读食物科学与工程专业。本科时代列入院科协，获取“第十三届南京高校学生食物科技论坛二等奖”、“三勤学生一等奖学金”和“校良好卒业生”等声望。商讨生时代进入邦度肉品中央举行细胞培植肉商讨，卒业晚进入南京周子来日食物科技有限公司任研发助理，目前正在周光宏教讲课题组做科研助理。

　　本文《高密度培植对猪肌肉干细胞运道的影响》来历于《食物科学》2023年44卷第18期165-174页，作家：林玲，朱浩哲，蒋翊宸，郑燕燕，刘政，吴中元，丁世杰，周光宏。DOI！10。7506/spkx0928-315。点击下方阅读原文即可查看作品联系新闻。

　　练习编辑；北京林业大学生物科学与技能学院栾文莉；仔肩编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来历于作品原文及摄图网。

　　非热加工专栏：江苏大学邹小波、石吉勇教化等：米糠非热安靖化管理技能商讨起色