肝纤维化（HF）的发作兴盛与肠道微生物构成和宿主代谢的变动亲昵干系。芪甲柔肝汤（QJ）是临床行使的一种中药复方制剂，具有明显的临床疗效。然而，它对肠道微生物群和代谢产品变动的影响尚不显现。因而，本考虑旨正在阐发QJ对四氯化碳（CCl4）诱导的HF中肠道微生物群和代谢的影响。咱们采用40% CCl4诱导HF，然后赐与QJ解决6周；采用血清生化阐发、机合病理学、免疫机合化学、RT-PCR、16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学技巧来考虑QJ对CCl4诱导的大鼠HF模子的干涉功用。结果声明，QJ能有用改进CCl4诱导的肝脏炎症和纤维化。另外，QJ上调了肠道精密连结卵白（TJPs）的外达，并明显变动了少许肠道微生物的丰采，比方，与HF干系目标和TJPs亲昵干系的10个菌属。另外，代谢组学察觉有37种要害代谢产品对QJ解决有反响，并与HF-干系指数和TJPs亲昵干系。干系性阐发后察觉，有10个属和37种代谢产品之间存正在亲昵合连。此中，Turicibacter、Faecalibaculum、Prevotellaceae UCG 001和未分类的Pepcococcaceae也许是QJ箝制HF的要害肠道微生物。这些结果声明，QJ可能改进肝脏炎症和纤维化，这也许是通过改进肠道精密连结、医治肠道微生物群构成以及医治宿主代谢来杀青的。
译名：肠道微生物连结代谢组学揭示芪甲柔肝汤对CCl4诱导肝纤维化的守卫功用
肝功效测试显示，与比较（C）组比拟，M组的血清天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）程度明显升高。QJ解决后，这些程度明显低浸（图1B）。QJ还明显下调HF患者的肝脏指数（图1C）。如图1A所示，HE染色显示，C组肝细胞形态平常，罗列精密，肝本质中没有任何光鲜的病理或炎症细胞浸润。CCl4解决后，肝细胞显示出光鲜的脂肪变性、炎症和坏死迹象，QJ可减轻这些症状。咱们用qPCR检测各组肝脏炎症指数的转化，结果显示，模子（M）组的IL-1β、IL-6和TNF-α程度明显升高，QJ解决明显下调了这一转化，这进一步证明了QJ箝制了CCl4诱导的肝脏炎症（图1D）。
（A）肝切片H&E染色，比例尺=200 μm；脂肪变性（黄色箭头）、炎症细胞浸润（血色箭头）和坏死（玄色箭头）。（B）肝功效目标：AST、ALT和ALP（n=8）。（C）肝指数推算：肝重/体重×100%（n=8）。（D）肝机合中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的相对外达（n=6）。*，p0。05。**，p＜0。01。
Masson染色及其半定量阐发（图2A、B）显示，相对付C组，M组可睹大方纤维条纹以至假小叶变成，而QJ明显减轻了CCl4诱导的纤维化。机合学上，HF的特质是肝脏机合毁坏和ECM太过浸积，I型胶原是ECM的苛重因素。肝星状细胞（HSC）活化是ECM爆发的苛重细胞出处，α-SMA是HSC活化的标记物。咱们采用IHC和qPCR检测各组肝脏中I型胶原和α-SMA的外达。结果声明，M组I型胶原和α-SMA的均匀积分光密度值（IOD）值和mRNA外达明显填充，但正在用QJ解决后明显箝制（图2A、C、D）。上述结果注明了QJ对CCl4诱导的HF的箝制功用。
C组回肠HE染色显示肠机合机合清楚，细胞形式平常，无光鲜炎症转化（图3A）。相反，CCl4模子导致结缔机合疏落罗列，肠绒毛高度和隐窝深度低浸，炎症细胞浸润。然而，QJ给药还原了肠绒毛高度和隐窝深度，没有光鲜的炎症转化。
精密连结卵白动作肠黏膜上皮细胞之间的苛重“桥梁”，对付庇护肠上皮障蔽的机合完善性幽静常功效至合主要。精密连结的毁坏会毁坏肠道上皮障蔽，这也许会使肠道微生物及其代谢产品变更并加剧先前存正在的肝病。考虑声明，初次打针CCl4后，Occludin正在小鼠小肠中的外达明显低浸，细菌易位（CCl4，4次）先于肠道微生物失衡（CCl4 24次；桥接纤维化）。肠上皮精密连结卵白变动惹起通透性填充也许讲明了CCl4诱导的肝毁伤模子中早期细菌易位的理由。Claudin-1、Occludin和ZO-1是肠精密连结卵白（TJPs）的主要构成个别。咱们通过IHC和qPCR测定它们的均匀IOD值和mRNA外达。回肠的IHC阐发，如图3A、B所示，显示CCl4筑模后Claudin-1、Occludin和ZO-1的均匀IOD值明显低浸。假使云云，外达值正在QJ解决后得以还原。另外，咱们通过qPCR丈量的mRNA外达与IHC结果一概（图3C）。考虑结果声明，CCl4模子导致TJPs下调，这也许导致无益的肠道微生物及其代谢产品通过肠肝轴影响肝脏。然而，QJ对CCl4诱导的肠上皮障蔽毁伤具有有益功用。
咱们操纵α众样性评估肠道微生物群的充裕度和众样性。Ace、Chao 1和Shannon的指数声明，CCl4诱导后肠道微生物群的充裕度和众样性填充。然而，服用QJ后，Ace和Chao 1指数消浸（图4A）。结果声明，QJ解决抵消了HF对肠道微生物群充裕度的影响。
然后，咱们操纵基于加权unifrac的PCoA和ANOSIM来阐发各组之间肠道微生物群落机合的转化。ANOSIM（R=0。613，p=0。016，增补图S1D）显示，三组之间的肠道微生物机合存正在明显分歧。PCoA（PC1=62。62%，PCo2=13。39%）显示C组与M组齐备阔别。另外，与M组比拟，QJ组的肠道微生物构成更靠拢C组（图4B）。上述结果声明，QJ医治了大鼠肠道微生物群的群落机合。
Bugbase用于预测革兰氏阴性菌和阳性菌丰采发作明显转化的各组的潜正在外型（图4D）。M组与C组比拟，革兰氏阴性菌丰采明显升高，革兰氏阳性菌丰采明显低浸，而QJ还原了它。正在门程度上，咱们总共判定了10种肠道微生物，此中厚壁菌门和拟杆菌门是两个最具上风的门，占肠道微生物构成的90%以上（图4C）。如图4C–E所示，与C组比拟，M组的有益菌厚壁菌门程度低浸，拟杆菌门的含量更高。然而，正在QJ解决后，厚壁菌门和拟杆菌门的相对丰采发作了逆转（图4C、F）。
咱们实行LEfSe阐发，以确定各组中具有统计学事理的生物标记物和苛重肠道微生物（图4E、F；增补外S1、S2）。对数LDA得分越大，各组之间肠道微生物的分歧就越明显。基于LDA评分3，M组正在拟杆菌门中显示出Muribaculaceae和普雷沃氏菌的富集，正在厚壁菌门中显示为丹毒丝菌科、梭菌科和消化球菌科，正在变形菌门中显示为肠杆菌科，正在放线菌门中则显示为双歧杆菌科。C组和QJ组均产生乳杆菌科、未提拔瘤胃菌（属于Clostridia UCG 014）、理研菌等的富集。考虑结果声明，CCl4诱导后，肠道微生物机合发作了相当大的转化，QJ或许医治或改进这些转化。如图4E、F所示，正在属程度上，有19个共有属的丰采发作了明显转化。另外，正在物种程度上，QJ解决导致大肠杆菌的下妥协约氏乳杆菌和Limosilactobacillus reuteri（即罗伊氏乳杆菌）的上调。这些肠道微生物也许正在QJ箝制HF中发扬主要功用。
（A）alpha众样性阐发。（B）PCoA阐发。（C）肠道微生物群构成正在门程度上的转化。（D）基于BugBase的肠道微生物群外型，包含革兰氏阳性和革兰氏阴性。（E）通过LEfSe阐发C组和M组之间的肠道微生物分歧。（F）通过LEfSe阐发，M组和QJ组之间的肠道微生物分歧。LDA阐发的对数得分阈值为3。0。条形图的颜色展现肠道微生物与丰采较高的组相对应。NS，p0。05；*，p0。05；**，p＜0。01。
为了考虑各组的代谢特质，咱们操纵肠道实质物样本实行了非靶向代谢组学阐发。OPLS-DA显示，C组与M组阔别，M组与QJ组阔别（增补图S2A，D）。相应的置换检讨创设了精良的有用性和牢靠性，没有显示出“过拟合”（增补图S2B，E）。火山图显示了分别的代谢物（图5A、B）。遵循M组和QJ组之间的分歧代谢产品，咱们阐发了QJ箝制HF的代谢途径。干系的KEGG途径包含药物代谢—细胞色素P450、脂肪酸降解、牛磺酸和亚牛磺酸代谢以及赖氨酸降解（图5D）。
正在C与M和M与QJ之间，有82种联合的分歧代谢产品（共分歧代谢产品），一齐这些都受到QJ的反向医治（图5C）。正在消释KEGG或LIPID MAPS或HMDB数据库中缺乏注脚的代谢物，以及未正在HMDB平分类的代谢物后，共有61种分歧代谢物（增补外S3），它们也许是QJ箝制HF的主要代谢物。
（A）C组和M组之间的火山图。（B）M组和QJ组之间的火山图。（C）分别代谢物的维恩图。（D）M组和QJ组之间变动代谢产品富集途径的可视化阐发。
（A）HF干系指数、TJPs与19个共有属的干系性阐发。（B）HF干系目标、TJPs和61种共分歧代谢产品之间的干系性阐发。（C）10个共有属和36种要害代谢产品之间的干系性阐发。代谢途径或分类显示正在右侧：蓝色注脚为KEGG代谢途径；黄色字符展现LIPID MAPS分类；玄色字符展现HMDB分类。黄色星号：（1）≥8个目标与某些属或代谢产品亲昵干系；（2）通过QJ疗养逆转。*，p0。05；**，p＜0。01。
肝纤维化正在环球周围内变成了很高的疾病职守，但抗纤维化疗法的医疗需求仍有待餍足。然而，中药正在抗HF方面有很大的潜力。正在本考虑中，咱们察觉QJ也许通过医治肠道菌群失妥协代谢繁芜来发扬抗HF功用（图7）。
动物测验结果声明，高剂量QJ组抗HF成就最好。因而，本考虑仅操纵高剂量QJ组，听从4R原则。正在这项考虑中，QJ改进了肝功效，箝制了肝脏炎症和纤维化，这与之前的考虑一概。考虑声明，QJ的干涉还原了HF大鼠体内TJPs（Claudin-1、Occludin和ZO-1）的外达，以仍旧肠道障蔽的平常功效，并通过医治肠道中的无益微生物和代谢产品省略肝毁伤。据报道，TJPs缺乏惹起的肠障蔽毁伤是胆碱缺乏L-氨基酸限度饮食、硫代乙酰胺、胆总管结扎和CCl4诱导临床肝硬化和HF的病理机制苛重理由。
16S rRNA测序结果显示，QJ医治肠道微生物群的充裕度和群落机合。HF中肠道微生物的充裕度明显填充，与之前的考虑结果一概。另外，QJ逆转了CCl4诱导的HF中某些肠道微生物丰采的转化。正在门程度上，正在M组中，厚壁菌门的丰采低浸，而拟杆菌门的丰采填充，这与先前报道的HF中的肠道菌群失调犹如。然而，QJ挽救了这些转化。一项前瞻性部队考虑察觉，NAFLD肝硬化先证者的negativicutes富集，梭菌明显省略。正在急性肝衰竭测验中，Clostridia UCG 014与ALT和AST程度呈负干系，声明其对肝脏健壮的潜正在有益影响。正在本考虑中，正在CCl4诱导后，革兰氏阴性菌的丰采明显填充，而未提拔的瘤胃有益菌（属于Clostridia UCG 014，Clostridia）的丰采低浸。脂众糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的一种因素。革兰氏阴性菌正在M组中含量更高，也许爆发更众的LPS。正在肠肝轴，肠障蔽的毁伤推进LPS从肠向肝的转运，LPS可通过激活TLR4信号通途加重肝毁伤。另外，这项考虑还察觉，QJ填充了其他肠道微生物的丰采，这些微生物也许对肝毁伤或HF具有守卫功用，如乳杆菌、约翰氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和理研菌。乳杆菌对庇护肠道稳态至合主要。一项考虑申报称，约氏乳杆菌JNU3402通过乳酸PKA-SREBP-1c途径守卫NAFLD。正如先前的考虑所声明的那样，食用乳杆菌也许是戒备和疗养HF的可行步调。罗伊氏乳杆菌可能通过加强FXR信号通途来减轻酒精诱导的肝毁伤。另外，罗伊氏乳杆菌可能通过Nrf-2/HO-1-NF-κB途径介导肠道TJPs的外达，从而改进急性肝衰竭大鼠的肠道障蔽功效。另外，小肠细菌太过成长的肝硬化患者中理研菌丰采消浸。
图7 QJ可能通过医治肠道菌群失妥协代谢繁芜以及改进肠道精密连结来发扬抗HF功用
然而，丹毒丝菌科（Turicibacter、Faecalibaculum和Dubosiella）、肠杆菌科（大肠埃氏-志贺氏菌和i）、Fournierella和Prevotellaceae UCG 001的丰采正在M组中最高，包含潜正在的无益菌。QJ下调了这些细菌。丹毒丝菌科（Turicibacter或Faecalibaculum）正在NAFLD小鼠中填充。与无/轻度HF的NAFLD比拟，具有光鲜纤维化的NAFLD患者产生Turicibacter的丰采填充。患有HCC的肝硬化患者的丹毒丝菌程度是没有HCC的患者的三倍。另外，咱们正在HF患者中察觉肠杆菌科的丰采明显填充，而且肝脏中移位的大肠杆菌可能通过TLR5/MYD88/TWIST1途径诱导内皮-间质转化，从而加剧NAFLD小鼠的HF。Lanthier等人察觉大肠埃氏-志贺氏菌是MAFLD纤维化受试者肠道微生物群的特质。同时，文冬姜姜油树脂正在NAFLD小鼠中显示出巨大的保肝和肠道菌群医治功用，从而低浸了Fournierella的丰采。咱们正在正在D-氨基半乳糖诱导的肝毁伤和急性酒精性肝毁伤中察觉Prevotellaceae UCG 001填充。
很众考虑报道，中药及其生物活性因素，如姜黄醇和余甘子水提取物，通过医治代谢转化来改进HF。另外，考虑仍旧察觉京尼平甙、委陵菜酸、肝龙胶囊和连翘脂素通过医治甘油磷脂、氨基酸、花生四烯酸或胆汁酸代谢来减轻CCl4诱导的HF。因而，本考虑还通过非靶向代谢组学考虑了QJ对肠道实质物代谢的影响，并确定了61种主要的共分歧代谢物，这些代谢物可能被QJ反向医治。此中，有37种代谢产品与HF干系指数和TJPs显示出猛烈的干系性，声明它们也许是QJ医治代谢的要害标记物。这些代谢产品涉及木脂素、胆汁酸、脂质、药物代谢—细胞色素P450、苯丙氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢等。
代谢产品2′-Hydroxyenterolactone、7-Hydroxyenterolactone和（±）-肠内酯属于木脂素类。正在本考虑中，它们与HF干系指数呈明显负干系，与TJPs呈明显正干系。据报道，竹叶柴胡、连翘和五味子中的木质素具有抗HF功用。正在本考虑中，两种胆汁酸干系代谢产品与HF干系指数呈明显正干系，与TJPs呈明显负干系。Trihydroxycoprostanoic acid（即3α， 7α， and 12α-trihydroxy-5β-cholestanoic）是胆固醇生物合成为胆汁酸的中央体。7-酮脱氧胆酸属于脱氧胆酸。它正在NASH小鼠中上调，并跟着NAFLD疾病的开展和纤维化阶段而填充。代谢产品2-Phenylethyl 3-phenyl-2-propenoate和5-Hydroxy-3，3′，4′，7，8-Pentamethoxyflavone是苯丙素的成员。苯丙烷代谢始于氨基酸苯丙氨酸。代谢产品3-(2-Hydroxyphenyl) propionic acid与HF干系指数呈明显负干系，与TJPs呈正干系，并插手苯丙氨酸代谢。一项考虑申报称，正在胆道闭锁后患有HF的儿童中，（13）C-苯丙氨酸呼吸测试检测到苯丙氨酸代谢明显低浸。代谢产品5-L-Glutamyl-牛磺酸是牛磺酸和亚牛磺酸代谢的中央体，与一齐HF干系指数明显正干系。同时，它的填充与高脂血症和橙黄决明素诱导的肝毒性相合。Luo， Xiaomin等的考虑声明，余甘子水提取物对非酒精性脂肪肝HF的疗养功用也许与牛磺酸和亚牛磺酸代谢相合。
另外，咱们还揭示了10个属和37种共分歧代谢产品之间的干系性，这些代谢产品与HF干系指数TJPs亲昵干系，并受QJ的医治。此中，Turicibacter、Faecalibaculum、Prevotellaceae UCG 001和未分类的Pepcococcaceae是与37种共分歧代谢产品合连最亲昵的属，它们也许是QJ箝制HF的中心地道微生物。
假使云云，咱们目前的考虑仍有少许限度性，包含16s rRNA测序和非靶向代谢组学的样本量较小，以及仅实行干系性考虑。全体的功用机制应正在他日的考虑中进一步阐明。另外，QJ对肠道微生物的医治需求通过扩张样本量和正在无菌小鼠中实行粪便微生物移植来验证，而且该当操纵体外模子来验证要害代谢产品对HF的功用机制。另外，还需求进一步的考虑来证明肠道微生物群和宿主代谢转化之间的干系机制，并研究特定的肠道微生物和干系代谢产品动作QJ箝制HF的主要靶点。
总之，咱们的考虑声明，QJ可能箝制CCl4诱导的肝脏炎症和纤维化。咱们初次提出，这些功用也许与肠道微生物和代谢繁芜的医治以及肠精密连结卵白的改进相合。
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